膜蛋白细胞外相互作用综合分析的创新技术

发布时间：2024-02-26 16:28:29 栏目：精选百科

导读 体内的许多蛋白质与其他蛋白质形成复合物，决定细胞的命运。因此，蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)的分析是了解靶蛋白生物学功能的关键过程。膜...

体内的许多蛋白质与其他蛋白质形成复合物，决定细胞的命运。因此，蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)的分析是了解靶蛋白生物学功能的关键过程。膜蛋白占人类基因的30%以上，在细胞功能中发挥着至关重要的作用。已知许多膜蛋白形成复合物来发挥其功能，因此阐明膜蛋白 PPI 对于理解蛋白质功能至关重要。然而，分析 PPI，尤其是活细胞的细胞外蛋白质-蛋白质相互作用 (exPPI) 的技术发展一直滞后。最近，为大规模 PPI 分析而近距离标记蛋白质的邻近标记方法引起了人们的关注。然而，针对膜蛋白胞外区域的邻近蛋白标记方法主要涉及使用具有细胞毒性的分子进行 PPI 分析，这促使人们寻找针对活细胞的系统。



研究结果

爱媛大学蛋白质科学中心独立开发了邻近依赖性生物素标记酶AirID(Kido等人，eLife 2020)，该酶可对邻近蛋白质的赖氨酸残基进行生物素化。已有几项研究使用邻近依赖性生物素标记酶进行 exPPI 分析，但它们涉及形状与其原始结构显着不同的转基因蛋白质，因此尚不清楚分析结果在多大程度上反映了原始相互作用。为了准确了解活细胞细胞膜上发生的相互作用，有必要开发一种可以直接靶向细胞表达的蛋白质进行 exPPI 分析的技术。因此，我们的研究小组启动了这项研究，前提是可以通过创建一种分子(FabID)来分析 exPPI，该分子将 AirID 与识别膜蛋白胞外域的抗体的抗原识别位点融合。

分析 exPPI 的膜蛋白是表皮生长因子受体 EGFR，这是一种位于细胞膜上的癌症基因蛋白。当将FabID和生物素添加至表达EGFR的上皮样癌来源的细胞(A431细胞)(以下称为上皮癌细胞)时，在细胞培养水平上确认可以使用FabID将细胞膜上的EGFR生物素化。

通过将生物素标记与德岛大学开发的用于分析生物素化蛋白质的 FabID 和质谱法相结合，我们成功鉴定了许多新型 EGFR 相互作用蛋白。已鉴定的蛋白质有可能成为新的药物靶点。

EGFR 通过与称为 EGF 的配体结合来向细胞传递信号。已知当EGF与EGFR结合时，各种蛋白质与EGFR的胞内结构域结合，形成蛋白质复合物。目前，广泛用作癌症治疗的EGFR酪氨酸激酶抑制剂被认为是通过与EGFR结合并抑制EGFR胞内结构域介导的蛋白质复合物的形成来发挥其治疗作用。然而，当EGFR与EGF(配体)结合或EGFR酪氨酸激酶抑制剂(药物)作用时，根本没有观察到EGFR的配体依赖性和药物依赖性exPPI变化。因此，我们使用 FabID 观察了培养细胞中发生的 EGFR 配体依赖性和药物依赖性 exPPI 变化。因此，我们是世界上第一个发现当配体和药物与 EGFR 结合时 exPPI 发生动态变化的研究。

连锁反应

几乎所有生物体都使用膜蛋白在细胞内外传递信息。因此，分析膜蛋白的exPPI有望直接促进受体生物学的进步。此外，由于大多数商业药物通过靶向膜蛋白发挥作用，因此膜蛋白被认为是重要的药物靶点。然而，寻找新的膜蛋白药物靶点具有挑战性，这一直是制药行业的一个重大问题。本研究中开发的 FabID 技术不仅可以使用活细胞进行 exPPI 分析，还可以用于识别新的药物靶点。此外，FabID 被发现可以捕获配体依赖性和药物依赖性的 exPPI 变化，而这些变化尚未通过常规方法进行分析。未来，通过使用 FabID 的 exPPI 分析来识别新的药物靶点，以及详细分析商业药物结合时膜蛋白 exPPI 的变化，预计将为商业药物的开发做出重大贡献。

研究组织与支持

这项研究是由爱媛大学蛋白质科学中心、德岛大学尖端医学科学研究所、东京药科大学生命科学学院、东北大学医学研究科分子药理学系、和长滨生物科学技术研究所生物科学系。